Dostęp Otwarty

Preparat bezpośredni – barwienie metodą Grama

Jest to prosta, tania i szybka metoda diagnostyczna o czułości 75-90%.5,17,25 U chorych leczonych antybiotykami przed badaniem PMR czułość obniża się nawet do 9,1%,26 choć w badaniu Bohra i wsp. czułość barwienia metodą Grama u 481 duńskich pacjentów z ZOMR po zastosowaniu antybiotyku spadła nieznacznie (z 56 do 52%).20 Także badania w grupie amerykańskich dzieci wykazały nieznaczne obniżenie czułości metody.21

Czułość zależy od gatunku bakterii i wynosi 90% dla S. pneumoniaeS. aureus,27,28 86% dla H. influenzae,29 75% dla N. meningitidis, 50% dla Gram ujemnych pałeczek oraz <50% dla L. monocytogenes i bakterii beztlenowych.30 Swoistość tej metody w przypadku niektórych bakterii sięga 100%.4,16,31

Testy lateksowe

Testy lateksowe (latex agglutination, LA) służą do wstępnej diagnostyki bakteryjnego ZOMR, bezpośredniego wykrywania jakościowego w PMR, surowicy lub moczu antygenów następujących bakterii: H. influenzae typu B, S. pneumoniae, N. meningitidis grupy B oraz Escherichia coli K1. Wynik jest dostępny w ciągu 15 minut.32 Choć cechują się zmienną czułością (78-100% dla H. influenzae typu B, 59-100% dla S. pneumoniae i 22-93% w przypadku meningokokowego ZOMR) powinny być stosowane w diagnostyce.26,33,34

Dzięki LA można wykazać obecność antygenów bakteryjnych jeszcze po wyjałowieniu PMR, a antygeny H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae można wykazać we krwi i PMR do 10 dni od rozpoczęcia antybiotykoterapii. Thirumoorthi i Dajani stwierdzali antygeny H. influenzae typu B w moczu, surowicy i PMR do 3 dni od rozpoczęcia antybiotykoterapii.35

Zaletą LA jest fakt, że pozwalają one na wykrycie antygenów pochodzących również z martwych komórek bakteryjnych. Metoda polega na reakcji rozpuszczalnych bakteryjnych antygenów polisacharydowych obecnych podczas zakażenia w płynach fizjologicznych (PMR, surowica, mocz) z cząsteczkami lateksu opłaszczonymi swoistymi przeciwciałami. Obecność w materiale swoistych antygenów powoduje powstawanie kompleksu antygen-przeciwciało widocznego w postaci aglutynacji.

Antygeny bakteryjne można wykrywać także w surowicy i moczu, ponieważ rozpuszczalne polisacharydy błony komórkowej bakterii przechodzą przez komórki śródbłonka kapilarów i są wydzielane do moczu. W związku z tym mocz może być alternatywnym do PMR materiałem diagnostycznym.36 Surowica jest gorszym materiałem do badania, ponieważ antygeny polisacharydowe mogą łączyć się z przeciwciałami i innymi białkami surowicy, mogą być metabolizowane lub usuwane przez limfocyty.37

Ograniczeniem LA są niespecyficzne reakcje krzyżowe, np. z czynnikiem reumatoidalnym, zhemolizowanymi erytrocytami czy białkiem obecnym w badanym materiale. Ponadto ograniczenia mogą wynikać z niskiego stężenia antygenów w badanym materiale. Użycie pepsyny, białka A i EDTA zmniejsza częstość reakcji niespecyficznych, ale wymaga podgrzewania próbek przez 5-15 minut. Podgrzewanie uwalnia antygeny bakteryjne już związane z białkami PMR. Niestety antygen N. meningitidis jest wrażliwy na ciepło i nie można go wykazać testami LA, jeśli próbka została podgrzana do 100˚C.38,39 Opisano także krzyżowe reakcje między reagentem LA H. influenzaeS. pneumoniae, N. meningitidis typu C, S. aureusE. coli.40

Uzyskanie negatywnego wyniku testu w kierunku swoistego antygenu bakteryjnego nie wyklucza rozpoznania bakteryjnego ZOMR.

Metoda PCR

Testy amplifikacji kwasów nukleinowych, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), są także przydatne w diagnostyce bakteryjnego ZOMR.41 Tzanakaki i wsp. oceniali przydatność multipleksowego PCR do wykrywania bakterii N. meningitidis, S. pneumoniaeH. influenzae typu B, który cechował się całkowitą selektywnością. Zarówno dodatnia, jak i ujemna wartość predykcyjna wynosiły >99%.42 Czułość i swoistość metody PCR w diagnostyce ZOMR o etiologii S. pneumoniae waha się od 92 do 100%.43

Zaletą metod opartych na PCR jest możliwość uzyskania wyników dodatnich nawet do 72 godzin od wdrożenia antybiotykoterapii, ponieważ wykrywany jest także materiał pochodzący z zabitych komórek bakterii. Metoda PCR sprawdza się także wtedy, gdy do badań pobrano bardzo małą ilość materiału klinicznego, z czym często mamy do czynienia u dzieci. Jeśli w pracowni nie jest możliwe szybkie wykonanie takiego badania, to materiał kliniczny należy po pobraniu zabezpieczyć i zbadać później na miejscu lub wysłać do ośrodka, który takie badania wykonuje. W Polsce jest to Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Diagnostyki Zakażeń Ośrodkowego Układu Nerwowego (KOROUN).44

W KOROUN stosuje się metodę PCR do potwierdzania etiologii bakteryjnej ZOMR wywoływanych przez najczęstsze czynniki etiologiczne: N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae, L. monocytogenes, S. agalactiaeE. coli. Dla szczepów otoczkowych H. influenzae, oprócz identyfikacji gatunku, istnieje również możliwość określania typów serologicznych, a w przypadku N. meningitidis najczęstszych grup serologicznych – A, B, C, Y i W-135. Dla pneumokoków możliwa jest identyfikacja gatunku i wybranych typów serologicznych. Materiałem klinicznym przydatnym w diagnostyce molekularnej są: pełna krew, surowica, PMR i materiał pobrany post mortem (krew z komór serca, wycinki śledziony, nerki, płuc, wątroby i fragmenty zmienionej krwotocznie skóry [wybroczyny]). Wymagana minimalna objętość PMR do badania PCR to 200 μl.45

Istnieją także doniesienia o przydatności oznaczania genu rmpM Neisseria meningitidis bezpośrednio w PMR z zastosowaniem swoistych starterów. Amplikon o wielkości 308 bp genu rmpM nie wykazuje homologii z innymi organizmami i może być stosowany jako marker genetyczny bakteryjnego ZOMR o etiologii Neisseria meningitidis.46

Badanie immunologiczne

W przypadku neuroboreliozy zastosowanie znajdują metody oceniające wewnątrzoponową syntezę przeciwciał przeciwko B. burgdorferi przy zastosowaniu testów Western blot do badania płynu mózgowo-rdzeniowego i testów typu immunoblot.47

Typowanie serologiczne jest jedną z metod diagnostycznych, które w przypadku wielu gatunków bakteryjnych utraciło swoją dawną pozycję na rzecz nowszych, szybszych, bardziej powtarzalnych i rozdzielczych metod genetycznych. Krajowy Ośrodek Referencyjny w Warszawie typuje serologicznie szczepy N. meningitidis metodą ELISA.44 Obecnie metodą aglutynacji szkiełkowej za pomocą specyficznych surowic określa się typy serologiczne H. influenzae (A-F). Serotypy S. pneumoniae określa się w reakcji pęcznienia otoczek. Ze względu na wymaganą dużą liczbę próbek (ponad 90 serotypów) typowanie to wykonuje się w niewielu ośrodkach na świecie.44

Badanie pęcznienia otoczek (reakcja Quellunga)

Jest to metoda rzadko używana, przydatna jedynie dla szczepów posiadających otoczki (np. S. pneumoniae, N. meningitidis, otoczkowe H. influenzae). W badaniu tym kompleks antygen-przeciwciało na powierzchni bakterii powoduje zmiany jej otoczki, co widać pod mikroskopem. Otoczka staje się przezroczysta i spęczniała. Metoda ta wymaga dużego stężenia przeciwciał i doświadczonego personelu. Może służyć do identyfikacji gatunku, ale przede wszystkim jest wciąż metodą referencyjną w serotypowaniu pneumokoków.48