Spis treści

Do zapamiętania
• Nauka dotycząca prenatalnej diagnostyki genetycznej rozwija się w tempie, które jeszcze kilka lat temu było nie do wyobrażenia.
• Analizę pozakomórkowego DNA płodu cechuje bardzo wysoki wskaźnik wykrywalności trisomii 21: 99 lub 100%.

Wiarygodna nieinwazyjna diagnostyka aberracji chromosomowych płodu, która mogłaby zastąpić inwazyjne procedury, takie jak biopsja kosmówki czy amniopunkcja, od dawna była „świętym Graalem” położnictwa. Wygląda na to, że obecnie możliwa jest

prenatalna diagnostyka genetyczna oparta na analizie pozakomórkowego DNA płodu obecnego we krwi matki.

Możliwość analizy pozakomórkowego DNA płodu izolowanego z krwi matki oraz jej potencjalne zastosowanie zostały po raz pierwszy opisane 15 lat temu. 1 Praca Kitzmana i wsp., opublikowana w czerwcu 2012 roku, w której autorzy donoszą o nieinwazyjnym zsekwencjonowaniu całego genomu 18,5-tygodniowego płodu przy wykorzystaniu próbek krwi matki oraz śliny ojca, nadała tej technologii nowy wymiar, czyniąc z metody wykrywania aberracji chromosomowych czy chorób monogenowych diagnostykę prenatalną całego genomu płodu, uwzględniającą choroby dziedziczone recesywnie lub dominująco zgodnie z genetyką mendlowską. 2

Badania przesiewowe i rzeczywiste wykrywanie trisomii na podstawie badania pozakomórkowego DNA płodu obecnego we krwi matki początkowo opierały się na analizach próbek pochodzących z ciąż, w których płód był dotknięty trisomią oraz ciąż, w których płód był zdrowy. 3, 4, 5

W 2011 i następnie w 2012 roku pojawiły się doniesienia o analizie próbek krwi matek, u których wykonywano jednocześnie tradycyjne badania inwazyjne w postaci biopsji kosmówki lub analizy płynu owodniowego uzyskanego podczas amniopunkcji. 6, 7, 8, 9, 10, 11 Wyniki okazały się zachęcające. Wstępne doniesienia dotyczyły kobiet już zakwalifikowanych do biopsji kosmówki lub amniopunkcji (w ciążach dużego ryzyka), a próbki krwi pobierano przed wykonaniem procedury inwazyjnej. Ostatnio w podobnie przeprowadzonym badaniu odnotowano równie korzystne wyniki w grupie młodszych kobiet (średnia wieku 31,8 roku), która lepiej odzwierciedla ogólną populację ciężarnych (populacja małego ryzyka). 10

Nie jest nadużyciem stwierdzenie, że nauka dotycząca prenatalnej diagnostyki genetycznej rozwija się w tempie, które jeszcze kilka lat temu było nie do wyobrażenia. Dla ginekologów położników wyzwaniem jest nie tyle śledzenie aktualnego piśmiennictwa technicznego, ile ocena przydatności nowych metod w opiece nad pacjentką oraz dowodów potwierdzających ich zastosowanie w klinice.

Wykrywanie trisomii 18 i 21: początki

Ponad 20 lat temu nasz zespół znalazł się wśród pionierów wykrywania trisomii u płodu metodą analizy jądrzastych krwinek czerwonych płodu izolowanych z krwi matki. Do analizy wykorzystywano technikę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (fluorescent in situ hybridization, FISH) z zastosowaniem sond swoistych dla poszczególnych chromosomów. 12 Bianchi i wsp. w 1992 i Gänshirt-Ahlert i wsp. w 1993 roku potwierdzili wyniki uzyskane przez nasz zespół. 13, 14

Po publikacji w 1993 roku szczegółowej pracy poświęconej aspektom technicznym metody wydawało się, że jej kliniczne zastosowanie jest nieuchronne. 15 Niestety, okazało się, że pozyskiwanie komórek płodowych w celach diagnostycznych wymagało zastosowania metody izolowania komórek aktywowanych fluorescencją (fluorescence-activated cell sorting) lub magnetycznie (magnetic-activated cel sorting). Obie techniki są pracochłonne i mało powtarzalne. Mimo to w wieloośrodkowym badaniu sponsorowanym przez National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) poświęconym wykrywaniu trisomii 21 u płodów czułość metody wyniosła 74%. 16

Pozakomórkowe DNA płodu

Zważywszy na trudności związane z pozyskiwaniem płodowych krwinek czerwonych i wprowadzeniem tej metody do praktyki klinicznej, uwaga naukowców została skierowana na pozakomórkowe DNA pochodzenia płodowego, które znajduje się w osoczu ciężarnych, zmieszane z pozakomórkowym DNA pochodzenia matczynego. 1 Wykrycie sekwencji DNA swoistych dla chromosomu Y we krwi matki potwierdziło pochodzenie materiału genetycznego od płodu płci męskiej, dzięki czemu udowodniono zasadność i skuteczność zastosowania tej metody.

We wspomnianym wcześniej badaniu NICHD 16 wykrycie sekwencji swoistych dla chromosomu Y było warunkiem sine qua non potwierdzenia obecności nienaruszonych komórek pochodzenia płodowego (płodów płci męskiej). Stwierdzenie jakościowej różnicy w DNA pochodzenia matczynego i płodowego nie stanowi trudności w sytuacjach, kiedy mamy do czynienia z sekwencjami swoistymi wyłącznie dla płci męskiej (jak w przypadku sekwencji DNA charakterystycznych dla chromosomu Y) obecnymi we krwi matki, co jednoznacznie wskazuje na płodowe pochodzenie DNA odziedziczonego po ojcu. Takie podejście – oparte na wykrywaniu jakościowych różnic w pozakomórkowym DNA pochodzenia matczynego i płodowego – szybko znalazło zastosowanie w wykrywaniu u płodu mutacji materiału genetycznego pochodzących od ojca. 17

Szczególnego znaczenia w położnictwie nabrała możliwość nieinwazyjnego wykrywania allelu Rh (D) pochodzenia ojcowskiego, który odziedziczył płód. Jest to szczególnie ważne u par, w których ojciec jest heterozygotą w układzie Rh, natomiast matka jest Rh ujemną homozygotą. Obecnie wykorzystanie pozakomórkowego DNA pochodzenia płodowego w celu określenia wskazań do podawania immunoglobuliny anty-D Rh ujemnym ciężarnym jest strategią szeroko akceptowaną w Europie. 18

Wykrywanie trisomii u płodu na podstawie badania pozakomórkowego DNA

Wziąwszy pod uwagę, że płodowe DNA stanowi zaledwie 5% całkowitego DNA pozakomórkowego obecnego we krwi matki, wykrywanie trisomii płodowych na podstawie jego analizy jest znacznie trudniejsze niż wykrywanie chorób monogenowych pochodzenia ojcowskiego. W przeciwieństwie do wykrywania różnic jakościowych omówionych powyżej diagnostyka trisomii wymaga wykrycia ilościowych różnic w DNA w ciążach dotkniętych trisomią płodu i ciążach prawidłowych, co wynika z faktu, że zarówno matka, jak i płód mają sekwencje DNA swoiste dla chromosomu 21.

Rozróżnienie ciąży, w której płód obciążony jest trisomią, od ciąży prawidłowej jest możliwe dzięki temu, że płód z trisomią 21 ma więcej sekwencji DNA swoistych dla chromosomu 21 niż płód zdrowy. Płód z trisomią 21 zamiast dwóch ma 3 chromosomy 21 pary. Ta niewielka, ale istotna różnica w całkowitej ilości sekwencji DNA swoistych dla chromosmu 21 obecnych we krwi matki jest możliwa do wykrycia. Zakładając, że DNA pochodzenia płodowego stanowi około 5% całkowitego DNA pozakomórkowego obecnego we krwi matki, w próbce krwi ciężarnej, której płód ma trisomię chromosomu 21, powinno być 2,5% więcej sekwencji DNA swoistych dla tego chromosomu niż w przypadku ciężarnej, której płód jest zdrowy. Ta niewielka, ale istotna różnica stanowi podstawę wykrywania trisomii (aneuploidii) opartego na analizie krwi matki. W tym celu wykorzystywane są dwie metody.

Równoległe sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA

Jedną z technologii, stosowaną w Stanach Zjednoczonych przez Sequenom (San Diego, Kalifornia) oraz Verinata Health (Redwood City, Kalifornia), jest równoległe sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA (massively parallel genomic sequencing, MPGS). W tej metodzie sekwencjonowaniu poddawana jest cała pula pozakomórkowego DNA (pochodzenia matczynego i płodowego). Spośród około 25 milionów sekwencji ocenie ilościowej podlegają te swoiste dla badanych chromosomów (21, 13, 18) i porównywane są z liczbą spodziewaną w przypadku diploidii.

Dotychczas ukazało się kilka doniesień poświęconych próbom ustalenia wartości progowych na podstawie badania wcześniej zdeponowanych próbek krwi ciężarnych. W pracy Chiu i wsp. 8 opublikowanej w 2011 roku spośród 576 zbadanych próbek osocza w 7% przypadków nie zdołano uzyskać wyniku, jednak wśród pozostałych próbek wykryto wszystkie 86 przypadków trisomii 21. Także w 2011 roku Ehrich i wsp. donieśli o prawidłowym zdiagnozowaniu wszystkich 39 przypadków trisomii obecnych wśród 449 analizowanych próbek osocza ciężarnych. 7 Nie odnotowano wyników fałszywie dodatnich.

W 2012 roku Bianchi i wsp. pracujący w Verinata w analizowanym materiale wykryli wszystkie z 89 przypadków ciąż dotkniętych trisomią 21. 8 Spośród wszystkich analizowanych próbek w 3% przypadków nie zdołano wyizolować wystarczającej ilości pozakomórkowego DNA. Dzięki zastosowanej metodzie wykryli także 35 z 36 przypadków trisomii 18 oraz 11 z 14 przypadków trisomii 13. Nie odnotowano fałszywie dodatnich wyników dla trisomii chromosomów autosomalnych. Także w 2012 roku naukowcy niemieccy donieśli o skutecznym zastosowaniu równoległego sekwencjonowania wielu fragmentów DNA techniką opisaną uprzednio przez Chiu, 6 co pozwoliło prawidłowo zidentyfikować wszystkie 8 przypadków trisomii 21 spośród całkowitej liczby 42 przebadanych próbek. 19 W tej samej publikacji badacze donoszą o próbach optymalizacji ilościowej oceny sekwencji swoistych dla trisomii 21 za pomocą nowych algorytmów obliczania wartości z tzw. z score.

Wspomniane prace dostarczają dowodów na możliwość skutecznej diagnostyki trisomii 21 u płodu opartej na analizie pozakomórkowego DNA z zastosowaniem modelu progu ilościowego. W przypadkach trisomii 13 i 18 zastosowanie technologii równoległego sekwencjonowania wielu fragmentów DNA daje wskaźniki wykrywalności poniżej 100%, ale wciąż są one bardzo duże.

Celowane sekwencjonowanie DNA

Część zespołów w celu wykrywania trisomii u płodu stosuje inną technikę: celowane sekwencjonowanie DNA (targeted DNA sequencing). W tej metodzie analizie ilościowej poddawane są jedynie sekwencje swoiste dla badanych chromosomów – na przykład chromosomów pary 21, 13 i 18 – w przeciwieństwie do wyżej opisanej techniki, w której sekwencjonowana jest cała pozyskiwana pula DNA pozakomórkowego zawierająca DNA ze wszystkich chromosomów matki i płodu. Wybrane fragmenty DNA można sekwencjonować, wykorzystując odpowiednie sondy.

Jeden z zespołów (Ariosa; San Jose, Kalifornia) w kolejnych publikacjach przedstawia zachęcające wyniki, które opiera albo na 99% prawdopodobieństwie (progu) wystąpienia trisomii 21, albo przeciwnie – mniejszym niż 1% prawdopodobieństwie, że płód jest prawidłowy. 5 Ariosa szacuje wartość ryzyka nie tylko na podstawie ilościowej oceny liczby sekwencji swoistych dla danego chromosomu, ale także biorąc pod uwagę wiek matki i odsetek DNA pozakomórkowego pochodzenia płodowego. Zaawansowany wiek matki z większym prawdopodobieństwem będzie wiązał się z wynikiem prawdziwie dodatnim niż z fałszywie dodatnim (tzn. czułość wzrasta z częstością występowania). Podobnie dokładność oceny ilościowej zależy od ilości DNA płodowego dostępnego badaniu.

Wstępne doniesienia wskazywały na 100% wykrywalność w próbkach z ciąż dotkniętych trisomią 21. 4 Następnie Norton i wsp. opublikowali wyniki badania kohortowego obejmującego grupę kobiet (średnia wieku 34,3 roku) poddawanych w większości przypadków diagnostyce w II trymestrze ciąży (średni wiek ciążowy 17 tygodni). 9 Nie uzyskano wyniku w 4,6% przypadków (1,8% niewystarczająca ilość DNA; 2,8% niepowodzenie metody). Wykryto wszystkie z 81 przypadków trisomii 21 oraz 37 z 38 trisomii 18. Odnotowano jeden przypadek wyniku fałszywie dodatniego (0,3%).

W jednym z ostatnich doniesień dotyczących opisywanej metody przedstawiono wyniki rutynowego badania przesiewowego kobiet w pierwszym trymestrze ciąży, o średniej wieku 31,8 roku. 10 Przypadki, w których nie uzyskano wyniku, stanowiły ponownie około 5%. Wykryto wszystkie z 8 przypadków trisomii 21 oraz 2 z 3 trisomii 18 (biorąc pod uwagę względnie młody wiek matek oczekiwano niewielkiej liczby przypadków trisomii). Wyniki fałszywie dodatnie stanowiły 0,1%.

Inny zespół pracujący w Stanach Zjednoczonych, wykorzystujący technikę celowanego sekwencjonowania (Natera; San Carlos, Kalifornia), rozpoznanie opiera na rodzicielskim polimorfizmie pojedynczych nukleotydów (single nucleotide polymorphisms, SNP), 31 technice, której przydatność udowodniono wcześniej w przedimplantacyjnej diagnostyce genetycznej. 20 Znajomość SNP rodziców pozwala określić wszystkie potencjalne genotypy płodu obejmujące trisomie, disomie i monosomie. Stosując statystykę bayesowską można określić wartości predykcyjne dla indywidualnych przypadków.

Wykorzystując tę metodę, Zimmerman i wsp. przebadali 166 próbek, analizując 11 000 SNP na chromosomach 13, 18, 21, X i Y. 11 W przebadanej puli wykryto: 2 przypadki trisomii 13, 3 trisomii 18, 11 trisomii 21, 2 monosomii 45,X oraz 2 zespołu Klinefeltera (47,XXY). We wszystkich przypadkach potwierdzono prawidłowo zdiagnozowaną liczbę chromosomów.

Potencjalną zaletą tej techniki jest możliwość jej zastosowania na mniejszej ilości pozakomórkowego DNA płodu. We wstępnych doniesieniach odsetek przypadków, w których nie zdołano uzyskać wyniku, wynosił 12,6, chociaż kryterium określenia badania jako przydatnego diagnostycznie było, w przeciwieństwie do innych badań, uzyskanie danych na temat wszystkich 5 chromosomów. Jeśli wziąć pod uwagę tylko 3 trisomie autosomalne (13, 18, 21), wówczas odsetek badań, w których nie uzyskano wyniku, jest porównywalny do innych doniesień.

Wnioski dla lekarza położnika

Obecnie można stwierdzić, że badanie pozakomórkowego DNA płodu cechuje wysoka skuteczność wykrywania trisomii 21: 99 lub 100%. Nieco mniejsza, ale wciąż satysfakcjonująca, jest skuteczność wykrywania trisomii 13 i 18. W porównaniu z modelowym obecnie badaniem przesiewowym w kierunku aneuploidii wykorzystującym ocenę stężenia PAPP-A i hCG we krwi matki w połączeniu z badaniem przezierności karku (nuchal translucency, NT) wydaje się, że badanie pozakomórkowego DNA płodu jest metodą lepszą. Wskaźnik wyników fałszywie dodatnich jest mniejszy niż 1%, a więc dużo mniejszy od 5% wyników fałszywie dodatnich cechujących badanie surowicy krwi matki w połączeniu z NT. Ponadto uważa się, że badanie pozakomórkowego DNA płodu w celu wykrywania aneuploidii jest bezpieczniejsze, ponieważ wymaga mniejszej liczby inwazyjnych procedur.

Zanim badanie to znajdzie ogólne zastosowanie, należałoby opracować technikę badania w czasie rzeczywistym, co oznaczałoby, że próbki krwi są na bieżąco analizowane w laboratorium, a wyniki badania dostępne w odpowiednio krótkim czasie. Na razie nie wiadomo, czy tak prowadzone badania potwierdzą 99% wskaźnik wykrywalności trisomii 21, jaki obserwowano w badaniu próbek ocenianych zbiorczo w trybie retrospektywnym, i czy uda się utrzymać niespełna 1% wskaźnik wyników fałszywie dodatnich.

Według badań walidacyjnych oraz badań wykorzystujących zdeponowane wcześniej próbki analiza pozakomórkowego DNA płodu w celu skrinigu aneuploidii, w porównaniu z dotychczas stosowanymi metodami wykrywania trisomii 21, wydaje się jednak bliska ideału. Pomiar przezierności karku prawdopodobnie pozostanie w użyciu w celu wykrywania istotnego poszerzenia (>3 lub >4 mm), co będzie wskazywało na obecność wady serca lub będzie wskazaniem do biopsji kosmówki w celu analizy chromosomów bez dalszych badań przesiewowych. Wydaje się, że badanie markerów aneuploidii we krwi matki zostanie jednak wycofane z pierwotnego skriningu aneuploidii u płodu.

Wyniki fałszywie dodatnie najprawdopodobniej mają jakieś uzasadnienie biologiczne i są tym samym niemożliwe do całkowitego wyeliminowania. Potencjalne wytłumaczenie ich uzyskiwania może stanowić zjawisko „znikającego aneuploidalnego bliźniaka”, ograniczony do łożyska mozaicyzm lub mozaicyzm komórek somatycznych u matki. W takich przypadkach w celu potwierdzenia rozpoznania konieczna jest biopsja kosmówki lub amniopunkcja. Badanie pozakomórkowego płodowego DNA pozostanie zatem badaniem przesiewowym, a nie diagnostycznym, w wyniku którego podejmowane są decyzje dotyczące dalszego postępowania. Badanie weryfikujące w postaci biopsji kosmówki czy amniopunkcji wykaże prawidłowy kariotyp (zatem wynik fałszywie dodatni) dużo rzadziej, niż wykazałoby w przypadku weryfikowania nieprawidłowego wyniku badania markerów aneuploidii w surowicy krwi ciężarnej w połączeniu z oceną NT.

Wyniki nieprzydatne diagnostycznie

Co najmniej 5% analizowanych próbek nie przynosi przydatnych diagnostycznie wyników. Jednym z powodów jest niewystarczająca ilość pozakomórkowego DNA płodu, stanowiąca określony procent całkowitego DNA pozakomórkowego obecnego we krwi matki. Oczywistym rozwiązaniem mogłoby być powtórzenie badania po tygodniu, jednak okazuje się, że niekoniecznie przyniosłoby to lepsze rezultaty, gdyż ilość pozakomórkowego DNA płodu między 10 a 21 tygodniem nie zwiększa się wraz z wiekiem ciąży. Innym możliwym wytłumaczeniem jest zawodność metody. Problemy dotyczące kontroli jakości mogą zmniejszać się wraz z rosnącym doświadczeniem, ale z kolei to ostatnie może wiązać się z kłopotami wynikającymi z coraz większej liczby analizowanych próbek.

Obecnie badanie może być zaproponowane dopiero po 10 tygodniu ciąży, ponieważ wcześniej ilość DNA może być niewystarczająca. W odniesieniu do wczesnej diagnozy interesujące są ostatnie doniesienia o poprawnej diagnostyce mukowiscydozy i rdzeniowego zaniku mięśni w 63 przypadkach, w których przeprowadzono analizę komórek płodowego trofoblastu uzyskanych z krwi matek w pierwszym trymestrze ciąży, u których jednocześnie wykonywano biopsję kosmówki ze względu na objawy kliniczne. Procedura ta (Rarecells Diagnostics; Paryż) obejmuje analizę molekularną pojedynczych komórek trofoblastu, które izolowano przy użyciu filtra, począwszy od 5 tygodnia ciąży. 21

Koszty

Wyzwaniem dla szerszego zastosowania analizy pozakomórkowego DNA w celach diagnostyki prenatalnej są koszty. Jeden ze sprzedawców oszacował cenę badania wykorzystującego metodę równoległego sekwencjonowania wielu fragmentów DNA na około 2700 dolarów, biorąc pod uwagę wkład indywidualnych ubezpieczycieli. Idealnie koszty powinny być porównywalne do badania markerów w surowicy matki, chociaż nie muszą być one dokładnie takie same, jeśli założy się, że niespełna 1% wskaźnik wyników fałszywie dodatnich przyniesie oszczędności w wyniku mniejszej liczby wykonywanych procedur inwazyjnych.

Czy jesteśmy na to gotowi?

Załóżmy, że żaden z opisanych powyżej problemów nie okaże się poważną przeszkodą dla wprowadzenia metody do codziennego stosowania. Czy oznacza to, że środowisko położników i ginekologów powinno zmienić standardy postępowania dotyczące prenatalnych badań przesiewowych w kierunku aneuploidii i wprowadzić powszechnie analizę pozakomórkowego DNA płodu? Bądź co bądź, wskaźniki wykrywalności aneuploidii w tej metodzie wydają się o 10-15% wyższe od 85-90% wskaźnika wykrywalności charakterystycznego dla testu PAPP-A w połączeniu z oceną NT. Poza tym, podobnie jak w przypadku obecnego statusu diagnostyki wykorzystującej pozakomórkowe DNA płodu, także w przypadku oceny markerów w surowicy ciężarnej wstępne badania przed wprowadzaniem do praktyki klinicznej przeprowadzano jedynie na zdeponowanych wcześniej próbkach; duże badania kohortowe pojawiły się później.

Czy analiza pozakomórkowego DNA płodu powinna być proponowana jako jedyne badanie przesiewowe? Moim zdaniem powinna, ale niewątpliwie pojawią się propozycje połączenia jej z wybranymi elementami funkcjonujących programów przesiewowych wykorzystujących analizę markerów w surowicy krwi matki. Nie jest to jednak konieczne, a z pewnością mało praktyczne.

Skrining aneuploidii oparty na analizie pozakomórkowego DNA płodu powinien być procedurą na tyle skuteczną, aby nie wymagał przeprowadzania wcześniejszych badań. Dodatni wynik badania przesiewowego powinien wiązać się z bezpośrednim skierowaniem pacjentki na badanie inwazyjne, bez dodatkowych konsultacji. Pomiar NT w badaniu ultrasonograficznym powinien pozostać w użyciu ze względu na jego przydatność w wykrywaniu wad serca niezwiązanych z obecnością trisomii. Konieczne jest także kontynuowanie badań mających na celu wykrywanie wad cewy nerwowej – albo w badaniu ultrasonograficznym w drugim trymestrze, albo na podstawie oceny stężenia α-fetoproteiny w surowicy matki.

Czy pacjenci zaakceptują badanie pozakomórkowego DNA płodu jako badanie przesiewowe w kierunku aneuploidii u płodu? Oczywiście. Mały wskaźnik wyników fałszywie dodatnich sam w sobie jest atutem. Już teraz obserwujemy pacjentów zainteresowanych minimalizowaniem ryzyka wystąpienia wyniku fałszywie dodatniego i jego konsekwencji. Takie sytuacje są niepożądane, wiążą się z dużym stresem u pary i wymagają zastosowania procedury inwazyjnej. Pacjenci oczekują także wyższych wskaźników wykrywalności chorób u płodu.

W Wielkiej Brytanii nieinwazyjna diagnostyka prenatalna wykorzystująca pozakomórkowe DNA płodu jest szeroko stosowana u pacjentów z grupy dużego ryzyka wystąpienia chorób genetycznych sprzężonych z płcią. Z najnowszego doniesienia z tego kraju wynika, że pacjenci akceptują tę metodę, jednak konsultacja specjalisty jest równie ważna przed, jak i po badaniu.

Jest jeszcze jedno zastrzeżenie dotyczące analizy pozakomórkowego DNA płodu: są nim ograniczenia diagnostyczne metody stosowanej w obecnej postaci. Obecnie nie ma możliwości wykorzystania pozakomórkowego DNA płodu w nowej metodzie określanej jako porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy (array comparative genome hybridization, aCGH). Technika ta daje możliwość identyfikacji nie tylko wszystkich aneuploidii, ale także mikrodelecji i mikroduplikacji, które są zbyt małe, aby uwidocznić je w klasycznym badaniu kariotypu. Dlatego prenatalna aCGH wykonywana na pozakomórkowym DNA płodu miałaby daleko szersze zastosowanie niż proste wykrywanie trisomii 13, 18 i 21.

W ciążach dotkniętych wadami rozwojowym płodu, stwierdzonymi w badaniu ultrasonograficznym, zastosowanie metody aCGH pozwala wykryć dodatkowe 6% nieprawidłowości cytogenetycznych w stosunku do samego kariotypu, natomiast u ciężarnych w starszym wieku, bez nieprawidłowości płodu obserwowanych w USG, nawet 1,7% zaburzeń więcej w stosunku do klasycznego kariotypu. 23 Teoretycznie przeprowadzenie aCGH na pozakomórkowym DNA płodu jest możliwe, chociaż obecnie wydaje się, że prenatalna aCGH będzie wymagać nienaruszonych komórek płodowych uzyskiwanych drogą biopsji kosmówki lub amniopunkcji, lub też komórek trofoblastu płodu wyizolowanych z krwi matki. 21

Przyszłość badań chromosomowych u płodu

Wstępne doniesienia z lat 2011 i 2012 pozwalają z całą pewnością stwierdzić, że analiza pozakomórkowego DNA płodu jest skuteczną metodą wykrywania trisomii 21 u płodu. Wskaźnik wykrywalności obecnie sięga niemal 100%. Wskaźnik wyników fałszywie dodatnich nie przekracza 1% i jest dużo mniejszy niż 5% wskaźnik cechujący badanie I trymestru w postaci testu PAPP-A i ultrasonograficznego pomiaru NT. Oznacza to zmniejszenie liczby inwazyjnych procedur.

Jeżeli kolejne wyniki okażą się równie korzystne, będzie to przesłaniem, aby zalecić wykonywanie analizy pozakomórkowego DNA płodu jako badania pierwszego rzutu w skriningu aneuploidii. Pamiętając, że wstępne doniesienia na temat tej metody dotyczyły pacjentek z grupy dużego ryzyka, nieuniknione jest, że początkowo wytyczne będą sugerowały wykonywanie tego badania w takich populacjach pacjentek.

Nowe stanowisko American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) odzwierciedla dane z dotychczasowego piśmiennictwa. 24 O tym, jakiego przyspieszenia nabrała ta dziedzina wiedzy, świadczy choćby to, że w stanowisku tym zabrakło odniesienia do jednego badania obejmującego populację małego ryzyka. 10 Wydaje się, że w chwili pojawienia się większej liczby podobnych doniesień konieczne będzie jego uaktualnienie.

W grudniu 2012 roku Beijing Genetics Institute opublikował chińskie doświadczenia poparte zachęcającymi wynikami badań prowadzonych w ciągu 2 lat u 11 105 ciężarnych zarówno z grupy małego, jak i dużego ryzyka. 25 Spośród 49 ośrodków w 7 pacjentki kwalifikowano do badania niezależnie od wyników wcześniejszej oceny ryzyka. Wykryto wszystkie 143 przypadki trisomii 21 oraz wszystkie 47 trisomii 18. Odnotowano jeden fałszywie dodatni wynik trisomii 21 oraz 1 fałszywie dodatni wynik trisomii 18. Biorąc pod uwagę to doniesienie, które ukazało się już po publikacji stanowiska ACOG, 24 istnieją silne przesłanki, aby ACOG rozszerzyło w swych wytycznych zastosowanie badania na całą populację ciężarnych.

Jak przyczajona w tle postać z obrazu Magritte’a, na swoją kolej czeka prenatalna aCGH. Metoda ta ma szanse istotnie zwiększyć liczbę wykrywanych zaburzeń, nie tylko trisomii. Czy wskazane jest zatem w dalszym ciągu poszukiwanie tylko trisomii u płodu w sytuacji, kiedy dzięki aCGH można wykryć znacznie więcej? Jaki koszt jesteśmy w stanie ponieść, aby uniknąć inwazyjnych procedur diagnostycznych? Czy wykrywanie większej liczby zaburzeń metodą aCGH (lub sekwencjonowania całego genomu płodu) przebije nieinwazyjną analizę pozakomórkowego DNA płodu, przyczyniając się tym samym do zwiększenia liczby badań inwazyjnych? Czy metoda analizy pozakomórkowego DNA płodu jest w stanie rozwinąć się tak, aby dorównać skutecznością aCGH?

Z drugiej strony, jeżeli uda się opracować prostą metodę pozyskiwania nienaruszonych komórek trofoblastu z krwi ciężarnej, czy analiza tego materiału nie byłaby atrakcyjniejszą opcją niż badanie pozakomórkowego DNA płodu, które trzeba izolować z mieszaniny DNA pozakomórkowego matki? Jak widać, dziedzina badań prenatalnych z pewnością będzie się dalej rozwijać.

Kluczowe zagadnienia
• Zakładając, że płodowe DNA stanowi 5% pozakomórkowego DNA obecnego we krwi matki, w próbce pochodzącej od ciężarnej, której płód jest dotknięty trisomią 21, powinno się znajdować 2,5% więcej sekwencji charakterystycznych dla chromosomu 21 niż w przypadku zdrowego płodu.
• Analiza pozakomórkowego DNA płodu nie będzie badaniem diagnostycznym, którego wynik będzie decydował o dalszym postępowaniu; będzie ono miało charakter badania przesiewowego.
• Konsultacja specjalisty może być równie ważna przed, jak i po badaniu.
• Dotychczasowe prace dostarczają dowodów na możliwość skutecznej diagnostyki trisomii 21 u płodu na podstawie analizy pozakomórkowego DNA z zastosowaniem modelu progu ilościowego. W przypadkach trisomii 13 i 18 zastosowanie metody równoległego sekwencjonowania wielu fragmentów DNA daje wskaźniki wykrywalności poniżej 100%, ale wciąż są one bardzo wysokie.
• Czy pacjenci zaakceptują badanie pozakomórkowego DNA płodu jako badanie przesiewowe w kierunku aneuploidii u płodu? Oczywiście. Mały odsetek wyników fałszywie dodatnich sam w sobie jest tu atutem.
• Teoretycznie przeprowadzenie aCGH na pozakomórkowym DNA płodu jest możliwe, obecnie jednak wydaje się, że prenatalna aCGH będzie wymagać nienaruszonych komórek płodowych uzyskiwanych drogą biopsji kosmówki lub amniopunkcji, lub też komórek trofoblastu płodu wyizolowanych z krwi matki.

Contemporary OB/GYN, Vol. 58, No 1, p. 26. Nonivasive fetal diagnosis. Promise versus practicality.

Piśmiennictwo
  1. 1. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 1997;350(9076):485-487.
  2. 2. Kitzman JO, Snyder MW, Ventura M, et al. Noninvasive whole-genome sequencing of a human fetus. Sci Transl Med. 2012;4(137):137ra76.
  3. 3. Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(42):16266-16271.
  4. 4. Ashoor G, Syngelaki A, Wagner M, Birdir C, Nicolaides KH. Chromosome-selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first-trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012; 206(4):322.e1-322.e5.
  5. 5. Sparks AB, Struble CA, Wang ET, Song K, Oliphant A. Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012;206(4):319.e1-319.e9.
  6. 6. Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ. 2011;342:c7401.
  7. 7. Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol. 2011;204(3):205. e1-205.e11.
  8. 8. Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, et al; Maternal Blood is Source to Accurately Diagnose Fetal Aneuploidy (MELISSA) Study Group. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012;119(5):890-901.
  9. 9. Norton ME, Brar H, Weiss J, et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012;207(2):137.e1-137.e8.
  10. 10. Nicolaides KH, Syngelaki A, Ashoor G, Birdir C, Touzet G. Noninvasive prenatal testing for fetal trisomies in a routinely screened first-trimester population. Am J Obstet Gynecol. 2012;207(5):374.e1-374.e6.
  11. 11. Zimmermann B, Hill M, Gemelos G, et al. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenat Diagn. 2012;32:1-9.
  12. 12. Price JO, Elias S, Wachtel SS, et al. Prenatal diagnosis with fetal cells isolated from maternal blood by multiparameter flow cytometry. Am J Obstet Gynecol. 1991;165(6 part 1):1731-1737.
  13. 13. Bianchi DW, Mahr A, Zickwolf GK, Houseal TW, Flint AF, Klinger KW. Detection of fetal cells with 47,XY,+21 karyotype in maternal peripheral blood. Hum Genet. 1992;90(4):368-370.
  14. 14. Gänshirt-Ahlert D, Börjesson-Stoll R, Burschyk M, et al. Detection of fetal trisomies 21 and 18 from maternal blood using triple gradient and magnetic cell sorting. Am J Reprod Immunol. 1993;30(2-3):194-201.
  15. 15. Simpson JL, Elias S. Isolating fetal cells from maternal blood. Advances in prenatal diagnosis through molecular technology. JAMA. 1993;270(19):2357-2361.
  16. 16. Bianchi DW, Simpson JL, Jackson LG, et al. Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study. Prenat Diagn. 2002;22(7):609-615.
  17. 17. Saito H, Sekizawa A, Morimoto T, Suzuki M, Yanaihara T. Prenatal DNA diagnosis of a single-gene disorder from maternal plasma. Lancet. 2000;356(9236):1170.
  18. 18. Clausen FB, Christiansen M, Steffensen R, et al. Report of the first nationally implemented clinical routine screening for fetal RHD in D-pregnant women to ascertain the requirement for antenatal RhD prophylaxis. Transfusion. 2012;52(4):752-758.
  19. 19. Stumm M, Entezami M, Trunk N, et al. Noninvasive prenatal detection of chromosomal aneuploidies using different next generation sequencing strategies and algorithms. Prenat Diagn. 2012;32(6):569-577.
  20. 20. Johnson DS, Gemelos G, Baner J, et al. Preclinical validation of a microarray method for full molecular karyotyping of blastomeres in a 24-h protocol. Hum Reprod. 2010;25(4):1066-1075.
  21. 21. Mouawia H, Saker A, Jais JP, et al. Circulating trophoblastic cells provide genetic diagnosis in 63 fetuses at risk for cystic fibrosis or spinal muscular atrophy. Reprod Biomed Online. 2012;25(5):508-520.
  22. 22. Lewis C, Hill M, Skirton H, Chitty LS. Fetal sex determination using cell-free fetal DNA: service users’ experiences of and preferences for service delivery. Prenat Diagn. 2012;32(8):735-741.
  23. 23. Wapner RJ, Martin CL, Levy B, et al. Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis. N Engl J Med. 2012;367(23):2175-2184.
  24. 24. Committee opinion no. 545: noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Obstet Gynecol. 2012;120(6):1532-1534.
  25. 25. Dan S, Wang W, Ren J, et al. Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11 105 pregnancies with mixed risk factors. Prenat Diagn. 2012;32(13):1225-1232.
Komentarz
prof. dr hab. n. med. Grzegorz H. Bręborowicz

We współczesnej medycynie perinatalnej diagnostyka prenatalna stanowi bardzo istotny element oceny stanu płodu, prognozy co do dalszego jego rozwoju oraz jakości życia w przyszłości. Istnieją dwa kierunki tego typu badań – inwazyjne oraz nieinwazyjne. Chociaż w ostatnich latach nastąpił niezwykle dynamiczny rozwój badań nieinwazyjnych, należy je nadal traktować jako uzupełniające. Obecnie, ze względu na ich dostępność, najczęściej badane są określone markery biochemiczne w surowicy krwi matki, ocenia się też przezierność karku w badaniu ultrasonograficznym. Stosując różne kombinacje tych badań, wykonywanych w różnych okresach ciąży (test podwójny, potrójny…), uzyskano wysokie wskaźniki wykrywalności anomalii genetycznych u płodu, osiągające wartości 85-90%.

Artykuł dr Simpsona omawia obecne możliwości prenatalnej diagnostyki genetycznej opartej na analizie pozakomórkowego płodowego DNA. Możliwości jego izolacji z krwi matki zostały opisane ponad 15 lat temu przez zespół Lo. W tym czasie do diagnostyki wprowadzane były nowe techniki badań genetycznych, które pozwoliły na prawie 100% identyfikację zaburzeń chromosomowych. Wyniki tych badań są o kilka procent wyższe w porównaniu do dotychczas stosowanych metod biochemicznych połączonych z badaniem ultrasonograficznym. Istotne jest również to, że charakteryzują się one bardzo małym odsetkiem wyników fałszywie dodatnich (poniżej 1%).

Postęp w diagnostyce prenatalnej wykorzystującej badania genetyczne jest niezwykle dynamiczny. Nowe, czasami przełomowe wyniki badań są publikowane w odstępach kilkumiesięcznych. Przykładem może być stanowisko American College of Obstetricians and Gynecologists przedstawione w opinii nr 515 opublikowanej w 2012 roku, które zaleca tego typu badania w populacji dużego ryzyka. W ciągu kilku miesięcy od pojawienia się tego dokumentu opublikowano prace (np. zespołu Nicolaidesa) wskazujące na wartość tego typu diagnostyki również w populacji małego ryzyka. Także w technikach badawczych obserwujemy bardzo szybki postęp. Autor artykułu opisuje takie badania, jak równoległe sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA czy celowane sekwencjowanie DNA, a w kilka miesięcy po ukazaniu się tego artykułu pojawia się publikacja Chena i wsp.,1 w której opisano nieinwazyjną sekwencyjną metodę oceny całego genomu płodu. Badania te są w pewnym sensie kontynuacją wcześniejszych badań przeprowadzonych przez zespół Kitzmanna.

Szczególną wartością komentowanej pracy jest dyskusja nad dalszymi kierunkami rozwoju diagnostyki prenatalnej. Autor, członek zespołu, który przed ponad 20 laty zajmował się wykrywaniem trisomii u płodu na podstawie analizy jego krwinek czerwonych izolowanych z ustroju matki, przedstawia w pracy metody, z którymi wiąże nadzieje dalszego postępu. Szczególną uwagę skupia na porównawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy (array comparative genome hybridization, aCGH). Metoda ta pozwala na identyfikację mikrodelecji i mikroduplikacji. Chociaż teoretycznie można ją przeprowadzić na pozakomórkowym DNA, praktycznie korzystniejsza jest analiza całego materiału genetycznego z całych komórek płodowych. Pozyskiwanie takich komórek metodami nieinwazyjnymi otwiera nowy kierunek badań, ponieważ dotychczas pobierane one były w trakcie biopsji kosmówki, amniopunkcji lub kordocentezy. Alternatywą jest wychwytywanie komórek trofoblastu z krwi matki. W wielu ośrodkach na świecie prowadzone są w tym kierunku badania, których głównym celem jest uzyskanie maksymalnej liczby komórek płodu. Przykładem takich badań mogą być prace niemiecko-polskiego zespołu, który wykorzystując metody nanotechnologii, stworzył cewnik opłaszczony swoistymi przeciwciałami, umieszczany w naczyniu ciężarnej. Prace są zaawansowane i obecnie koncentrują się na uzyskaniu przeciwciała, które będzie się charakteryzowało największą swoistością w stosunku do komórek trofoblastu.2

Istotne jest to, że autor artykułu nie kwestionuje wartości dotychczasowych badań nieinwazyjnych stosowanych w diagnostyce prenatalnej, wskazując na stałą ich przydatność w diagnostyce niektórych wad układu krążenia (badanie przezierności karku) lub ośrodkowego układu nerwowego (α-fetoproteina).

W pełni uznając nowe technologie wprowadzane do diagnostyki prenatalnej, trzeba pamiętać o stale istniejących ograniczeniach związanych z ich wprowadzaniem. Dotyczy to ich kosztów, czasu oczekiwania na wynik, propagowania nowych technologii w środowisku medycznym oraz aspektów etycznych. Istnieją również ograniczenia diagnostyczne stosowanych dotychczas metod oceny pozakomórkowego DNA. Nie należy również oczekiwać, że stosując badania genetyczne, nasze końcowe rozpoznanie nie będzie obarczone pewnym, prawdopodobnie bardzo małym, błędem. Może on powstać w przypadku różnych postaci mozaicyzmu lub obumarcia jednego z płodów w ciąży wielopłodowej, nosiciela określonej anomalii.

Podsumowując, z pełnym przekonaniem należy stwierdzić, że obecnie widzimy jedynie pierwsze zwiastuny możliwości diagnostyki prenatalnej wykorzystującej technologie genetyczne. Ich szybki rozwój pozwala oczekiwać, że w najbliższych latach diagnostyka aneuploidii przy wykorzystaniu tych metod będzie badaniem rutynowym, które w wybranych sytuacjach będzie uzupełniane oceną pojedynczych mutacji.

Piśmiennictwo

1. Chen S, Ge H, Wang X, et al. Haplotype-assisted accurate noninvasive fetal whole genome recovery through maternal plasma sequencing. Genome Med. 2013;5(2):18.

2. Luecke K, Madejczyk M, Schniedermann J, et al. A novel approach for the in vivo isolation of fetal cells directly from the maternal circulation for prenatal diagnostics using a functionalized structured medical wire (FSMW). Arch Per Med. 2013;19(1):18-23.

Następny artykuł:

Zapobieganie uszkodzeniom układu moczowego w trakcie histerektomii. Cztery strategie zapewniające sukces

Joe Leigh Simpson
Joe Leigh Simpson
Facebook Podziel się LinkedIn Dodaj do Linkedin Wyślij mailem Wyślij mailem
Ulubione Dodaj do ulubionych