Sekret krwi, czyli szkarłatnej damy

sztuki leczenia.

W oczekiwaniu na mikroskop

O krwi po raz pierwszy rozumianej jako pozbawionej supranaturalnych cech cieczy mówił Hipokrates. Wymieniał ją wśród czterech płynów (humorów) odpowiedzialnych za stan organizmów. Zachowanie odpowiednich proporcji w ich stałej równowadze (eukrazja) skutkowało stanem zdrowia, zachwianie proporcjami (dyskrazja) prowadziło do schorzeń. Cztery hipokratejskie płyny to: sanguina, phlegma, chole i melachole. Teoria humoralna, jak zwykliśmy ją określać, stała się punktem wyjścia rozważań dla pokoleń lekarskich, kształtując zdecydowaną większość teorii w polu fizjologii i patologii na przestrzeni kolejnych stuleci. Inspirowała jednego z największych lekarzy starożytności Galena, dla którego życie jest zależne od dwóch, dzisiaj powiedzielibyśmy, układów: krwionośnego i oddechowego. Zarówno mechanizm powstawania i przepływu krwi, jak i mechanika oddychania stanowiły istotną część jego wykładu medycyny. Wedle niego boski pierwiastek – pneuma, który miał przemieszczać się tętnicami i aortą, mieszał się z krwią, „poruszając” szereg istotnych sił życiowych, w tym spiritus vitalis.

Musiało minąć 14 wieków, nim w 1628 roku William Harvey (ryc. 1) przedstawił światu śmiałą hipotezę, że krew krąży w układzie zamkniętym. Poparł ją następnie eksperymentem. Wyniki swoich obserwacji przedstawił w krótkim traktacie „Exercitatio Anatomica de Motu Cordis et Sanguinis in Animalibus”.

Ryc. 2. Antoni van Leeuwenhoek zwany królem mikroskopu.

Kilkanaście lat później, w 1642 roku, w holenderskim mieście Delft Antoni van Leeuwenhoek (ryc. 2) pod swojej konstrukcji mikroskopem dostrzegł, wyróżnił i opisał komórki krwi. Nazywany ojcem mikroskopii przez kilkadziesiąt lat regularnie dokumentował wyniki swoich obserwacji, wysyłając w sumie ok. 190 listów do Royal Society w Londynie, w których prezentował odkrywany przez siebie świat mikrokosmosu. Ciecz, którą od czasów Hipokratesa postrzegano jako mniej więcej jednorodną i opisywano zgodnie z prawami hydrauliki, zaczęła stopniowo ukazywać nowe, nieznane dotąd oblicze.

Musiało jednak minąć z górą sto lat, by ok. roku 1770 angielski lekarz i przyrodnik William Hewson (ryc. 3), dysponując ulepszonym mikroskopem, podjął się badania składu krwi, wyróżniając wówczas m.in. leukocyty oraz fibrynę. Skorygował również wcześniejsze ustalenia Leeuwenhoeka, wskazując, że w istocie erytrocyty mają kształt zbliżony do dysków, a nie sferyczny, jak twierdził holenderski badacz. Wykazał też, że istnieje wyodrębniona ściana komórkowa, co jednak zostało wówczas zignorowane.

Klucz do diagnostyki

Tymczasem wzrastające pod wpływem odkryć wybitnych uczonych – Lavoisiera i Newtona – chemia i fizyka dogłębnie przekształciły przyrodoznawstwo, wskazując na eksperyment jako metodę, a na matematykę jako podstawowy język opisu. I to właśnie wiek XVIII przyniósł ze sobą pierwsze doniesienia, że w istocie kolor krwi zależny jest od obecności w niej żelaza. Musiało jednak upłynąć sporo czasu, nim w 1840 roku dość przypadkowo Friedrich Ludwig Hünefeld po raz pierwszy uzyskał kryształy z zaschniętej próbki krwi, a w 1851 roku Otto Funke zaprezentował pierwszą laboratoryjną metodę ich pozyskiwania. Warto w tym miejscu przypomnieć, że w 1853 roku polski anatom Ludwik Karol Teichmann opracował oryginalną i znacznie efektywniejszą niż Funke metodę pozyskiwania heminy w postaci krystalicznej (chlorheminy). Kryształy, nazywane niekiedy na cześć odkrywcy, kryształami Teichmanna, stanowiły milowy krok w badaniach nad strukturą krwi. Jego ścieżką podążały badania znakomitego niemieckiego badacza Felixa Hoppe-Seylera (ryc. 4), którego nazywa się ojcem nowoczesnej biochemii.To właśnie on miał w 1864 roku wprowadzić do terminologii naukowej termin „hemoglobina”, udowadniając równocześnie, że to właśnie w niej obecne jest żelazo. U progu lat 70. XIX wieku Claude Bernard postawił hipotezę, że erytrocyty są odpowiedzialne za transport tlenu i że proces ów odbywa się na drodze reakcji chemicznej. Nie mógł jednak tego w ostateczny sposób udowodnić. Dokonali tego dopiero w 1904 roku Christian Bohr, Karl Hasselbalch i August Krogh, którzy na drodze szczegółowych badań analitycznych opisali oksyhemoglobinę – postać hemoglobiny połączonej z tlenem.

Ostatnia dekada XIX wieku przyniosła dalsze sukcesy na polu badań nad heminą. Ostatecznie to prace dwóch polskich uczonych – Leona Marchlewskiego i Marcelego Nenckiego doprowadziły do poznania chemicznej struktury heminy i wskazania na jej bliskie pokrewieństwo z pochodnymi chlorofilu. Marceli Nencki wraz ze swoim uczniem i współpracownikiem Janem Zaleskim dostarczyli ostatecznych dowodów na to, że cząsteczka heminy to w istocie żelazo otoczone pierścieniami pirolu. Wydawało się, iż jesteśmy coraz bliżej poznania chemicznej budowy krwi i jej biologicznej funkcji w życiu organizmów.

Także na polu nauk klinicznych potwierdzało się wyrażone jeszcze na przełomie XVIII i XIX stulecia przekonanie, że kluczem do nowoczesnej diagnostyki schorzeń są w istocie badania krwi. Wybitny internista Edmund Biernacki (ryc. 5) jako pierwszy opisał znaczenie zjawiska samoistnej sedymentacji krwi dla diagnostyki klinicznej. W 1897 roku zaobserwował, że szybkość opadania krwinek jest zmienna w zależności od różnych schorzeń i zaburzeń metabolicznych. W 20 lat później Robin Fåhræus powtórzył w nieco zmienionej formie doświadczenia polskiego lekarza. W 1921 wraz z Alfem Westergrenem stworzyli praktyczny model dla badania prędkości opadania erytrocytów (ESR).

Przedstawienie pełnej struktury

To, co jednak intrygowało wielu, a na co pomimo licznych starań nie znaleziono zadowalającej odpowiedzi, zawierało się w pytaniach, czym w istocie jest hemoglobina i jaką pełni funkcję. Nie ulegało też wątpliwości, że tylko przedstawienie pełnej jej struktury otworzy drogę do pełnego zrozumienia jej miejsca w świecie przyrody. To jednak okazało się zadaniem nader trudnym.

W 1935 roku Linus Pauling zainteresował się bliżej hemoglobiną, którą badał pod względem strukturalnego układu heminy, stawiając sobie pytanie o faktyczny charakter relacji wzajemnego oddziaływania czterech atomów żelaza na mechanizm łączenia i uwalniania cząsteczki tlenu. Współpracując z Charlesem D. Coryellem, zbadał powyższy mechanizm, wykazując, że w hemoglobinie występują niesparowane elektrony. Uczeni stwierdzili również, że w kontakcie z tlenem lub dwutlenkiem węgla układ atomów żelaza i właściwości magnetyczne hemoglobiny podlegają poważnym zmianom. Linus Pauling w dalszych badaniach w latach 40. wykazywał dużą plastyczność cząsteczki hemoglobiny pod wpływem czynników zewnętrznych, w tym także patologicznych. Prowadziło to w efekcie do wyodrębnienia w kolejnych latach szeregu „mutacji” hemoglobiny w różnych zmianach chorobowych.

Tymczasem w 1938 roku austriacki chemik Felix Haurowitz wykazał, że kiedy tlen reaguje z heksagonalnymi płytkami deoksyhemoglobiny, dochodzi do całkowitej dezorganizacji jej struktury, a w jej miejsce kształtują się miokloniczne, igłowate struktury oksyhemoglobiny. Tym samym zdołano udowodnić, że czynnikiem inicjującym zmiany w hemoglobinie jest tlen. Przypadkiem rok wcześniej Haurowitz spotkał się ze swoim powinowatym, liczącym sobie niespełna 24 lata, wówczas świeżo upieczonym studentem chemii Maxem Perutzem. Kiedy po latach Max Perutz powracał myślą do tego spotkania, nie miał najmniejszych wątpliwości, że zmieniło ono całkowicie jego życie. Wychowanek Uniwersytetu w Wiedniu zainteresowany był krystalografią, przy czym jak wyznawał, bez sprecyzowanego czy wymarzonego kierunku badań. W tym czasie zajmował się zmianami w strukturze form krystalicznych lodowców, co bardziej wiązało się z jego pasjami alpinistycznymi niż naukowymi. Nie znaczy to jednak, że nie miał na tym polu pierwszych znaczących osiągnięć, ustalając m.in. charakter mechanizmu przekształcania się śniegu w lód. Warto wspomnieć, że podczas II wojny światowej brał udział w jednym z osobliwszych projektów brytyjskiej armii, który zakładał skonstruowanie niezatapialnego lotniskowca. Jego głównym budulcem miał być lód! Ostatecznie ze względów finansowych i z powodu problemów logistycznych sprawę porzucono i lodowy lotniskowiec nigdy nie wyszedł poza wstępną fazę analiz.

Wracając do rozmowy z 1937 roku, to właśnie wówczas Felix Haurowitz wskazał Perutzowi, jak istotne stały się ostatnie wyniki prac nad hemoglobiną, dodając przy tym, że najlepszym miejscem do zgłębiania jej tajemnic jest Cambridge, gdzie tworzono nowe zespoły badawcze pracujące nad szeroko pojętymi zagadnieniami biochemii. Zebrawszy odpowiednie fundusze i zyskawszy rekomendację swojego wiedeńskiego profesora, Perutz zdecydował się na wyjazd do Anglii, by już na przełomie lat 30. i 40. rozpocząć intensywne badania nad molekularną strukturą dostrzeżonych przez Paulinga i innych badaczy przemian hemoglobiny. Wykorzystał w nich wzorzec dyfrakcji kryształów hemoglobiny w świetle promieniowania rentgenowskiego podczas różnych stadiów jej chemicznych przemian. Mijały lata, a pomimo usilnych starań nie zdołał jednak osiągnąć zadowalających rezultatów, a obrazy, które udało mu się zarejestrować, były dalece niepełne. Kiedy do jego laboratorium w Cambridge przybył śmiało wkraczający w królestwo biologii fizyk Francis Crick, Perutz tkwił w martwym punkcie. Przybysz szybko wdrożył się w prace „drużyny z Cambridge”, wykazując wzrastające zainteresowanie budową białek.

W drodze do Nobla

Na początku lat 50. Perutz rozpoczął intensywne badania nad strukturą chemiczną protein wchodzących w skład wełny i włosów, starając się dotrzeć do bliższego pokrewieństwa chemicznego białek z hemoglobiną. By zyskać pewność, musiał jednak poznać strukturę hemoglobiny i potencjalnie pokrewnych białek. Było to zatem równanie z dwiema niewiadomymi, którego rozwiązanie rysowało się mgliście. Tymczasem już w 1951 roku Linus Pauling poprawnie zidentyfikował podstawy strukturalne białek, wyodrębniwszy tzw. helisę α oraz arkusz β. Ustalenia Paulinga przełamały długotrwały impas, otwierając drogę innym badaczom. W 1953 roku Francis Crick, współpracując z Jamesem Watsonem, a korzystając ze znakomitych wyników Rosalind Franklin, przedstawił model podwójnej helisy DNA. Cztery lata później uczeń i współpracownik Perutza John Kendrew przedstawił po raz pierwszy pełną strukturę białka – mioglobiny, która jak słusznie przypuszczał, jest bliska hemoglobinie. Jednak „szkarłatna dama” nadal zazdrośnie strzegła swoich tajemnic, a Perutz czuł się wciąż bezradny. Analiza struktur kryształów z zastosowaniem metody rentgenografii strukturalnej, którą wspomniana Rosalind Franklin doprowadziła do perfekcji, sprawdziła się już wielokrotnie. W przypadku hemoglobiny jednak wciąż zawodziła. Światełkiem w tunelu okazał się tekst Augusta Riggsa z Harvardu, w którym autor wskazywał, że istnieje możliwość przyłączenia do hemoglobiny atomów ciężkich pierwiastków, a konkretnie rtęci. To było to, na co Perutz tak długo czekał. Kiedy zbadał w świetle rentgenografii strukturalnej zmodyfikowaną wedle propozycji Riggsa hemoglobinę, dostrzegł wyraźnie zmiany w układzie interferencji konstruktywnej. Wiedział, że po latach bezowocnych prób znalazł klucz do rozwiązania problemu. I po raz kolejny jego entuzjazm zaczął gasnąć. Uzyskiwane projekcje dyfrakcji nie były w stanie złożyć się na trójwymiarowy obraz hemoglobiny. Po wielu bezowocnych próbach, zmieniając kąty ustawienia aparatu RTG, Perutz uzyskał w końcu klarowny obraz hemoglobiny. Publikacja wyników odbyła się w 1960 roku na łamach „Nature”, a dwa lata później, wraz z Johnem Kendrew otrzymał Nagrodę Nobla z chemii. W tym samym roku z fizjologii nagroda została przyznana Francisowi Crickowi, Jamesowi Watsonowi i Maurice’owi Wilkinsowi za ich pracę nad DNA.